【期刊导读】侯金林/李咏茵/唐利波教授团队：干扰素α通过B细胞与T细胞的强化连接增强抗HBV特异性免疫应答

编者按：HBV的消除依赖于适应性免疫，慢乙肝（CHB）患者实现临床治愈的一个可行途径是通过免疫调节恢复乙肝病毒特异性免疫功能。干扰素α（IFN-α）对免疫系统具有广泛的作用，包括增强树突状细胞和单核细胞的功能，促进B细胞活化和抗体类别转换，以及在特定感染中差异塑造细胞免疫。目前IFN-α治疗的总体临床治愈率仍在不断的优化策略中逐步提高，因此诱导最佳的适应性免疫机制在对抗HBV中至关重要。

IFN-α介导的T细胞重构对于实现CHB患者的最佳治疗应答是必不可少的（相关链接）。而B细胞除了抗体的产生，还可通过递呈抗原和提供共刺激信号，促进保护性T细胞应答。来自B细胞的细胞因子，如IL-6、IL-27、IFN-γ和TNF-α，在T细胞分化中也很关键。但是对B细胞在IFN-α介导的HBV特异性免疫中的作用知之甚少。

近期，南方医科大学南方医院的侯金林教授、李咏茵教授和唐利波教授团队在Antiviral Research上发表了一项关于B细胞在IFN-α治疗期间的作用研究，结果表明：B细胞耗竭会损害功能性T细胞亚群，包括HBV特异性CD8+ T细胞，并导致HBV清除延迟；IFN-α治疗增强HBV特异性CD8+ T细胞的应答的潜在机制与PEG IFNα通过B细胞的抗原呈递和共刺激功能增强B细胞与T细胞的连接有关。

研究方法

本研究纳入南方医科大学南方医院6例未经治疗的HBV感染患者和4例HBeAg阳性、接受聚乙二醇干扰素α（PEG IFNα）治疗的患者。

分别利用患者血样及μMT小鼠模型（B细胞缺陷小鼠）进行实验分析：将pBlank质粒（空白对照）、pAAV/HBV1.2质粒（包含1.2倍全长A型HBV基因组）和pIFNα4质粒（使肝内IFN-α长期表达，并在小鼠模型中被证实具有有效的抗HBV作用）分别水动力注射在μMT小鼠模型中观察B细胞对IFN-α介导的T细胞应答的影响；利用患者血样进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），分析B细胞和T细胞亚群之间的串扰，以及IFN-α治疗的CHB患者纵向血样中潜在的分子和通路特征。

研究结果

01

B细胞缺乏会阻碍HBV特异性细胞免疫应答

与野生型小鼠（WT）相比，缺乏成熟B细胞的μMT小鼠外周总CD4+ T细胞的频率显著增加，可能是由于B细胞亚群数量减少。脾脏中CD4+ T细胞以及外周和脾脏中CD8+ T细胞的频率有所减少。在功能性T细胞亚群中，发现B细胞缺乏导致CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中效应记忆T细胞（TEM）和中央记忆T细胞（TCM）的频率减少。此外，与生发中心反应相关的滤泡辅助性T细胞（Tfh）和滤泡细胞毒性T细胞（Tfc）在μMT小鼠中的比例也整体下降。

在注射后的第28天和56天，μMT小鼠肝内CD8+ T细胞的频率显著低于对照组。同时，μMT小鼠肝内IFN-γ的产生减少，提示细胞毒性T细胞的功能减弱。因此，μMT小鼠的血清HBsAg、HBeAg、肝内HBcAg清除延迟，且不能产生血清抗-HBs。

不同小鼠模型的抗HBV细胞免疫应答

02

IFN-α介导的抗HBV应答具有B细胞依赖性

在体外使用PEG IFNα刺激CHB患者的外周血单核细胞（PBMCs），发现PEG IFNα的加入明显诱导了CD19+ B细胞上CD69和CD86的表达。pIFNα4质粒已被证实在小鼠模型中具有有效的抗HBV作用，但在μMT小鼠中注射pIFNα4质粒后，血清HBsAg和HBeAg水平升高，说明IFN-α发挥抗HBV作用的B细胞依赖性。

作为一种多效性细胞因子，IL-21在促进B细胞生存、分化和功能方面具有显著作用，且与CHB患者良好的治疗结果相关。在质粒注射后的第30天，Il21r-/-小鼠（IL-21受体缺失）脾内和肝内浆母细胞大量减少，尽管IFN-α诱导的B细胞分化在Il21r-/-小鼠中仍存在，但与WT相比明显减弱。此外，与对照组相比，注射pIFNα4的Il21r-/-小鼠HBV抗原清除能力仍保留，但有所减弱，提示IL-21参与了pIFNα4诱导的抗HBV作用，但并非完全必要。

B细胞和IL-21在IFN-α介导的抗HBV应答中的作用

03

IFN-α增强HBV特异性细胞免疫

在体外培养系统中观察到IFN-α诱导T细胞亚群的分化和颗粒酶B的产生。与pBlank组相比，注射pIFNα4的WT小鼠脾内CD4+ T细胞扩增，其次是CD8+ T细胞。同时，pIFNα4注射后第20天诱导脾内HBV包膜特异性产生IFN-γ的CD8+ T细胞频率显著增加，注射后第10天和第20天检测到肝内HBV核心特异性产生IFN-γ的CD8+ T细胞的频率显著增加，从而促使血清HBV DNA大幅降低。

IFN-α注射小鼠的抗HBV细胞免疫应答 ；C - F：用重叠肽刺激小鼠，检测脾内和肝内IFN-γ+CD4+和IFN-γ+ CD8+ T细胞的频率，这些重叠肽跨越HBV核心蛋白（core）、包膜蛋白（env）或总HBV蛋白（all）。

04

IFN-α增强的HBV特异性细胞免疫具有B细胞依赖性

在B细胞缺乏的情况下，pIFNα4组和pBlank组之间肝内HBV核心特异性CD8+ T细胞的频率没有差异，且在pIFNα4注射后第20天脾脏和肝脏中HBV特异性产生IFN-γ的T细胞没有增加。提示B细胞在IFN-α诱导的抗HBV细胞免疫中不可或缺的作用。

B细胞缺失的情况下，IFN-α诱导的细胞免疫应答

05

在PEG IFNα治疗过程中，B细胞介导的T细胞抗原呈递增强

对接受PEG IFNα治疗的HBeAg阳性CHB患者在0周、4周和12周收集的PBMCs进行scRNA-seq。拟时分析显示，IFN-α治疗能有效诱导T细胞向效应/记忆亚群的末端分化。

对差异基因（DEGs）进行分析，单核细胞、B细胞和T细胞中部分基因的表达在基线和治疗后有明显的差异，表明IFN-α治疗引发了强烈的免疫调节。通过GO功能富集分析将B细胞或T细胞在治疗第4周和12周时的表达谱与基线表达谱进行比较。在IFN-α处理后，B细胞中上调的DEGs富集在抗原处理和呈递途径，而T细胞的DEGs显著富集在与细胞因子应答、免疫效应过程、T细胞激活和IFN-γ产生的相关通路中。

PEG IFNα治疗的CHB患者适应性 免疫系统的单细胞测序拟时分析

B细胞或T细胞在治疗第4周和第12周与基线；对比上调的DEGs GO富集分析

06

IFN-α显著增强B细胞与T细胞的连接

利用CellPhoneDB和CellChat分析细胞间一般通信的纵向动态，B细胞亚群和CD8+效应亚群之间的通信明显上调。使用ICELLNET分析B细胞向T细胞的通信，B细胞亚群与T细胞，特别是CD8+ T细胞，连接增强。同时，共刺激分子对的相互作用在IFN-α治疗期间持续增强，表明B细胞发挥了抗原呈递功能，以帮助T细胞免疫。

通过scRNA-seq分析PEG IFNα 治疗过程中细胞间的纵向通信

肝霖君有话说

IFN-α以B细胞依赖的方式协调保护性HBV特异性细胞免疫，其潜在机制与由抗原呈递和共刺激相互作用所介导的B细胞与T细胞的强化连接有关，表明了IFN-α在先天性免疫和适应性免疫调节上的独有特征。已有数据表明PEG IFNα治疗慢乙肝有利于重塑B细胞亚群（相关链接），并且可以通过滤泡辅助性T细胞刺激B细胞分化，促进HBsAg血清学转换（相关链接）。也有研究证明了在HBV感染或其他病毒感染模型中B细胞增强CD8+ T细胞杀伤效应的途径，强调“B - CD8+ T细胞”增强效应的有益结果。本研究结果表明，B细胞在IFN-α治疗过程中参与细胞免疫方面具有不可替代的作用。B细胞缺失导致功能性T细胞亚群的应答受损，特别是在HBV感染背景下的CD8+ T细胞亚群。因此，以“IFN-α - B - T细胞”为靶点的潜在联合疗法可能有利于慢乙肝患者的治疗疗效。

参考文献：

Zhong S, Li Q, Wen C, et al. Interferon alpha facilitates anti-HBV cellular immune response in a B cell-dependent manner[J]. Antiviral Res, 2022, 207: 105420.