CRCL：CRISPR/CAS9可使总HBVDNA降低或发生突变

目前的研究认为，慢性乙肝病毒感染之所以能够持续存在，主要是因为缺乏有效的针对稳定HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)微染色体的新型治疗方法。法国里昂癌症研究中心(CancerResearchCenterofLyon，CRCL)研究人员进行了一项采用CRISPR/Cas9方法来靶向HBV基因组的研究，并研究了CRISPR/Cas9基因编辑后cccDNA的走向。

研究人员首先在表达HBV受体钠离子牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）的HepG2细胞中建立了一种核糖核蛋白(RNP)递送系统。其次，在建立感染后将核糖核蛋白(RNP)复合体进行递送，旨在确保cccDNA的靶向性。最后，在进行CRISPR/Cas9基因编辑后研究人员对细胞内外HBV参数进行分析。使用Southern印迹分析确定cccDNA的表达，使用RNA测序以确定突变的cccDNA是否具有转录活性。

研究结果显示，通过对不同的HBV特异性gRNA的筛查发现，无论是单一的还是组合的，都表明CRISPR/Cas9可以有效地影响HBV的复制。根据HBV基因组中的靶点，CRISPR/CAS9可使总HBVDNA降低或发生突变，两者都导致病毒转录本的减少。

除了cccDNA数量出现轻微减少，这种减少可能是由于降解的原因导致，研究人员持续观察到一个较小的ccccDNA片段的出现，通过PCR，Southernblot和RNA-seq分析表明该片段在转录上是具有活性的。

这项研究结果表明，这个“小cccDNA”是Cas9同时在两个靶位点诱导双链断裂，然后修复大片段时产生的产物。

通过核苷类似物(NAs)抑制HBVDNA复制的中间产物后，加入核糖核蛋白(RNP)复合体出现了cccDNA水平降低，这表明cccDNA确实是CRISPR/Cas9复合物的直接靶点。

综上所述，该项研究结果提示，用CRISPR/Cas9靶向乙型肝炎病毒会导致cccDNA的突变、裂解和修复，并且核苷类似物(NAs)和CRISPR/Cas9基因编辑两者合用具有有效的协同作用。

值得注意的是，Cas9诱导的效应是可持续的，表明乙肝病毒基因组发生了永久性的变化。

尽管gRNAs组合可引起截断，“小cccDNA”仍是具有转录活性的，并且有可能产生HBsAg。研究人员也表示，尽管看到上述结果，但仍有必要进行进一步和更长期的体内研究，以确定基因编辑的有效性和不可逆性。（更多肝病新药研究信息敬请关注“肝脏时间”微信公众号）！

信息来源

SAT376：TargetinghepatitisBviruswithCRISPR/Cas9approach