增强靶向cccDNA的CRISPR/Cas9的抗病毒疗效

编者按：第73届美国肝病研究学会年会（AASLD 2022）于当地时间2022年11月4日 - 8日在美国召开。会议期间披露了多项乙肝新药研究进展，肝霖君精选其中的重要进展与大家分享。

现有的抗HBV药物主要包括核苷和干扰素α，两者经有效联合可帮助慢乙肝患者实现临床治愈，但由于核苷和干扰素α均不直接靶向cccDNA，cccDNA无法完全清除，慢乙肝患者的完全治愈至今尚未实现。基因编辑疗法CRISPR/Cas9可直接靶向cccDNA而发挥抗病毒作用，具有完全消除HBV的潜力，但目前仍处于临床前研究阶段。

在AASLD 2022摘要中发表的一项研究结果表明，通过抑制非同源末端连接（NHEJ）介导的DNA修复机制可以增强靶向cccDNA的CRISPR/Cas9的抗病毒效果。

研究方法

研究人员设计了靶向HBV基因组的gRNA（HBV-gRNA）和非靶向HBV或人类基因组的对照gRNA（Cont-gRNA），将串联Cas9和HBV-gRNA（或Cont-gRNA）的慢病毒表达载体（HBV-gRNA/Cas9或Cont-gRNA/Cas9）转入感染HBV 19天的原代人肝细胞（PHHs）中。诱导表达Cas9的HBV易感细胞（HepG2-hNTCP-iCas9）用单个HBV-gRNA或Cont-gRNA慢病毒载体进行转染。HBV感染4天后，用多西环素（DOX）诱导Cas9表达。进一步用HBV治疗或DNA合成/修复途径相关药物处理这些细胞，并检测其在CRISPR/cas9介导的抗HBV治疗中的作用。

研究结果

HBV-gRNA转染降低了HepG2-hNTCP-iCas9细胞上清中HBV DNA和HBsAg水平，以及细胞内pgRNA和cccDNA水平；同样，HBV-gRNA/Cas9转染降低了PHHs上清中HBV DNA和HBsAg水平以及细胞内pgRNA和cccDNA水平。CRISPR/Cas9治疗不激活先天免疫系统。

恩替卡韦、干扰素α、Bay41-4109（衣壳组装调节剂）不改变CRISPR/Cas9对HepG2-hNTCP-iCas9细胞的治疗效果。作用于DNA合成/修复机制的药物中，CD437（DNA合成抑制剂）也不改变CRISPR/Cas9对HepG2-hNTCP-iCas9细胞的治疗效果，而奥拉帕尼（PARP抑制剂）显著增强了CRISPR/Cas9治疗的抗病毒疗效。抑制BRCA（对同源重组至关重要）不改变CRISPR/Cas9的治疗效果，但抑制PARP2或HPF1（参与DNA双链断裂修复的初始步骤），以及LIG4（对NHEJ至关重要，NHEJ是一种特殊的DNA双链断裂修复机制）显著增强了CRISPR/Cas9的抗病毒疗效。

研究结论

奥拉帕尼抑制NHEJ介导的DNA修复机制增强了靶向HBV基因组的CRISPR/Cas9的治疗效果。

肝霖君有话说

基因编辑CRISPR/Cas9技术提供了完全治愈慢乙肝的可能，但由于基因编辑效率、脱靶等方面原因，单靠CRISPR/Cas9完全消除HBV是比较困难的。本文研究显示经抑制NHEJ介导的DNA修复增强了CRISPR/Cas9的功效，这种新型组合疗法可能有助于基因编辑技术完全消除HBV的早日实现。

参考文献：

Murai K, Kodama T, Hikita H, et al. Olaparib enhances the anti-viral effect of CRISPR/Cas9 therapy targeting HBV genome via NHEJ-mediated DNA repair machinery. AASLD2022. Abstracts (1166).

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